在基因组编辑领域，单碱基编辑器通过将可编程的DNA结合蛋白与碱基修饰酶融合，实现在不引起DNA双链断裂的情况下，对基因组中特定碱基进行精确修改。尽管依赖于胞嘧啶碱基编辑器（CBE）或腺嘌呤碱基编辑器（ABE）介导的脱氨反应，这些编辑器能够实现C到T或A到G的突变，但它们在诱导所有类型的点突变，尤其是颠换突变方面仍存在局限性。

2024年2月19日，西湖大学生命科学院常兴团队与工学院原发杰团队在 Molecular Cell 上发表了一篇题为“Protein language models-assisted optimization of a Uracil-N glycosylase variant enables programmable T-to-G and T-to-C base editing”的研究文章。这项研究首次利用蛋白质语言模型（PLM）对尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）进行改造，开发出高活性突变体，该突变体能够识别正常的胸腺嘧啶和胞嘧啶。基于此，研究者构建了一种新型碱基编辑器TSBE，它能够有效地实现T到G或T到C的编辑。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.01.021

研究团队首先通过调整尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）的底物特异性，获得特异性识别胞嘧啶的胞嘧啶糖基化酶（CDG）和特异性识别胸腺嘧啶的胸腺嘧啶糖基化酶（TDG）。在nCas9和sgRNA的精确引导下，这些酶能够切割T或C碱基，实现一步创建无碱基位点，在后续的DNA修复过程中产生更特异和高效的颠换突变（图1）。

图1 基于尿嘧啶DNA糖基化酶变体开发新型碱基编辑器

研究团队首先将UDG变体CDG和TDG融合在SpCas9n的N端，得到的N-CDG只有较低的编辑C碱基的能力，N-TDG编辑T碱基的效果同样微弱。通过将CDG插入SpCas9n的中间得到CE-CDG，编辑C碱基的效率大大提高，碱基转换以C>G为主。然而将TDG插入SpCas9n的中间得到CE-TDG（TSBE1），编辑T碱基的效果仍不理想（图2）。

图2 TDG与SpCas9n的不同融合方式及编辑效率

为了进一步优化TSBE，研究者采用了蛋白质语言模型（PLM）来预测和设计TDG的高活性突变体（图3），这一策略显著提高了TSBE的蛋白进化效率。蛋白质语言模型借鉴了自然语言处理（NLP）中的“语言模型”概念，通过分析蛋白质氨基酸序列来预测其结构和功能。尽管蛋白质语言模型在特定酶的优化和分子进化中的应用尚属首次，但其潜力已在本研究中得到验证。

图3 蛋白质语言模型预测TDG突变体及实验验证的流程

通过设计语言模型打分和排名方案，研究人员选择出可能提高酶活性的TDG变体。通过实验验证突变体功能，发现在验证的48个预测的TDG突变体中，超过50％的突变体展现出1.5-11倍的酶活性增强，成功率远远高于随机诱变。优化后的TSBE能在人细胞系中有效地诱导T到G或T到C的碱基替换，并且能够精确地纠正肥胖小鼠模型db/db胚胎的致病突变（图 4）。

图4 TSBE在小鼠胚胎中高效诱导碱基转换

值得注意的是，近期通过随机突变和筛选UNG突变体，也有研究成功开发出了针对C和T碱基的颠换编辑器¹，并且某些增强TDG功能的突变与蛋白质语言模型预测的结果相一致。提示蛋白质语言模型与传统的随机突变和筛选方法，在蛋白质定向进化领域具有潜在的协同作用。

综上所述，本研究的发现不仅为开发新型碱基编辑器建立了新策略，而且还证明了利用蛋白质语言模型，无需大量特定任务训练数据或实验验证，即可用于酶的分子进化的巨大潜力。这些发现将为未来的基因组编辑技术发展开辟新的道路。

西湖大学常兴研究员和原发杰研究员为本文的共同通讯作者，博士研究生何燕和周禧彬为本文的共同第一作者，其他合作者包括博士研究生昌冲和刘维宽，博士陈格和科研助理李庚。本项目获得了国家自然基金委、浙江省自然基金委、西湖基因编辑中心以及西湖合成生物学与综合生物工程中心的资助；项目实施过程中得到了西湖大学实验动物中心以及生医平台的大力支持。

1. Ye, L., Zhao, D., Li, J., Wang, Y., Li, B., Yang, Y., Hou, X., Wang, H., Wei, Z., Liu, X., et al. (2024). Glycosylase-based base editors for efficient T-to-G and C-to-G editing in mammalian cells. Nature Biotechnology. 10.1038/s41587-023-02050-w.