自然界中的病原体存在许多因进化产生的变体（亚型），这些亚型的抗原表位差异导致难以筛选出单一的广谱中和抗体。艰难梭菌外毒素B（TcdB）就是一个典型的案例。由于艰难梭菌变种较多，精准检测其毒素亚型后再进行中和干预治疗在诊疗的及时性上存在不足，因此，开发出一种具有广谱作用的TcdB中和蛋白具有较大的现实意义。

艰难梭菌（Clostridioides difficile）是一种感染人类结肠的条件致病菌，可引发腹泻、结肠炎等肠道疾病，严重时可危及生命。在北美，每年报告的感染病例约达50万例，导致1.5万例死亡。在中国，炎症性肠病患者中艰难梭菌的检出率已接近欧美水平。艰难梭菌通过分泌外毒素TcdA、TcdB和CDT损伤肠道，其中TcdB是毒性最强的致病因子。TcdB具有多个亚型，临床上常见的包括TcdB1-4，它们可分为两个分支：分支1包含TcdB1和TcdB3，分支2则包括TcdB2和TcdB4。每个分支成员可通过两种不同的受体结合表位（RBI）识别宿主细胞中的不同受体蛋白：TcdB1和3通过RBI-1结合FZD1/2/7，通过RBI-2结合CSPG4；而TcdB2和4通过RBI-1结合TFPI，通过RBI-2结合CSPG4。这种受体识别的冗余性和复杂性使得传统方法难以制备具有广谱效应的高效中和抗体。

近日，西湖大学卢培龙与陶亮团队合作在《Nature Communications》杂志发表了题为“De novo design of mini-protein binders broadly neutralizing Clostridioides difficile toxin B variants”的研究论文。该研究“从头设计”（de novo design）了一种广谱的迷你中和蛋白，能够以高亲和力结合多种艰难梭菌毒素B（TcdB）亚型，并在细胞及动物模型中表现出高效且广谱的保护作用。

图1 广谱TcdB迷你结合蛋白的从头设计流程

研究团队采用蛋白质从头设计及虚拟筛选的方法，基于TcdB1与受体蛋白FZD2的结合面，首先设计并生成了一批候选迷你结合蛋白。迷你结合蛋白是由37-65个氨基酸组成的球状蛋白。然后将TcdB2叠合到TcdB1-迷你结合蛋白复合物上，经过虚拟筛选，获得具有广谱结合潜力的迷你结合蛋白。经高通量表征分析，编码为43829的迷你结合蛋白具备极高的热稳定性和亲和力，其对TcdB1-4的亲和力常数范围为10.1 nM至21.5 pM。通过冷冻电镜分析，43829在TcdB1-43829和TcdB4-43829复合物中的结构与设计模型的偏差（RMSD）均在1 Å以内，这表明设计的TcdB迷你结合蛋白是具有很高的准确性以及广谱结合效力。

为提升迷你结合蛋白的实用性，研究团队通过定向进化的方法，优化了迷你结合蛋白与TcdB2/4的结合能力，最终筛选出变体H3，其与TcdB2/4的亲和力常数分别为965 pM和278 pM，与TcdB1/3的结合能力与进化前相当。此外，为中和TcdB RBI-2表位，研究团队定向进化TcdB RBI-2的人源结合蛋白CSPG4-Repeat1，获得了亲和力为4-6 nM的变体5N2，与TcdB1-4的亲和力显著增强。经过实验验证，上述变体在细胞层面对TcdB引起的细胞损伤具有更强的保护能力。

最后，研究团队将可广谱结合TcdB两个表位的结合蛋白与IgG Fc异源二聚体融合表达，成功获得了Fc_H3_5N2融合蛋白。通过小鼠结肠结扎实验，研究团队验证了Fc_H3_5N2对四种TcdB亚型的中和效果，发现其能有效缓解结肠的水肿、上皮损伤等症状，展现出优秀的肠道上皮保护力（图2）。

图2 TcdB结合蛋白的体内中和效果

综上所述，本研究成功实现了广谱TcdB迷你中和蛋白的精准靶向从头设计，并在结构、生化、细胞等多个维度上验证了其功能。通过定向进化与蛋白质工程获得的Fc_H3_5N2融合蛋白可广谱中和临床常见的TcdB亚型，并在动物实验中验证了其对肠道的高效保护作用。这项工作为开发针对艰难梭菌感染的多肽抗体药物奠定了坚实的基础，同时为在蛋白质从头设计中开发针对不同靶点表位的广谱结合蛋白提供了有价值的参考方法。

西湖大学生命科学学院卢培龙研究员和医学院陶亮研究员为共同通讯作者。西湖大学生命科学学院博士后吕莘辰和访问学者张媛媛博士（浙江省人民医院）为本文的共同第一作者。本研究得到中国科技部、国家自然科学基金委、浙江省科技厅“尖兵”“领雁”研发攻关计划、西湖大学未来产业研究中心和西湖实验室的资助；同时得到了西湖大学高性能计算中心、冷冻电镜平台、质谱与代谢平台、晶体学平台和实验动物中心的大力支持。