2025年2月5日，西湖大学医学院董晨团队在Journal of Experimental Medicine上发表了题为“Regulatory T cells converted from T helper 1 cells in tumors suppress cancer immunity via CD39”的研究论文。该研究深入解析了肿瘤内调节性（Treg）细胞的发育路径与功能特性，揭示了T-bet⁺Treg细胞在肿瘤免疫中的关键作用，发现这些细胞通过高表达CD39抑制CD8 T细胞的功能，并提出了通过靶向T-bet⁺Treg细胞来增强抗肿瘤免疫反应的潜在策略，为癌症免疫治疗开辟了新的方向。

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https://doi.org/10.1084/jem.20240445

尽管调节性T（Treg）细胞在维持免疫耐受性中至关重要，但在肿瘤微环境中，它们的免疫抑制作用使肿瘤细胞能够逃脱免疫系统的监视，这使得研究肿瘤内Treg细胞的作用变得尤为关键。近年来，肿瘤微环境被发现能够促进Treg细胞的招募和发育，这一过程对肿瘤免疫逃逸至关重要。大量研究发现，肿瘤浸润的Treg细胞在许多癌症中显著增多，并且Treg细胞与CD8⁺T细胞的比例升高往往与癌症患者的不良预后相关。尽管如此，肿瘤微环境中Treg细胞的功能及其来源仍缺乏系统的研究。

肿瘤浸润的Treg细胞被认为是癌症免疫治疗的潜在治疗靶标。然而，系统性去除Treg细胞可能引发自体免疫反应。靶向Treg细胞上恒定表达的分子可能导致自体免疫副作用。因此，识别并选择性地靶向肿瘤微环境中主要的Treg细胞亚群至关重要。

根据来源，Treg细胞可分为两种亚群，即胸腺来源的天然Treg（tTreg）细胞和外周诱导的Treg（pTreg）细胞。tTreg细胞在胸腺内通过T细胞受体（TCR）与自我肽/主要组织相容性复合体（MHC）之间的高亲和力相互作用筛选生成。而pTreg细胞则是从常规CD4⁺T细胞在TCR刺激和转化生长因子（TGF)-β及白介素（IL)-2的作用下在外周产生的。FOXP3转录因子是这两种Treg细胞的标志，并且对它们在胸腺和外周的细胞谱系承诺或分化至关重要。有研究表明，神经元蛋白1（NRP1）可能作为tTreg细胞的特异性标志。尽管Treg细胞在肿瘤微环境中的积累已被长期报道，但肿瘤浸润Treg细胞的来源依然是一个存在争议并亟待解答的研究问题。

在应对环境信号时，Treg细胞可能表现出可塑性，并表现出类似于CD4⁺辅助T细胞的表型。最早在感染结核分枝杆菌的实验鼠中发现，T-bet⁺Treg细胞在炎症部位积累，抑制Th1介导的炎症反应。类似地，在单核细胞增生李斯特氏菌感染的实验鼠中，T-bet⁺Treg细胞在次级淋巴器官中富集，抑制Th1型炎症反应。此外，T-bet⁺Treg细胞还在人的咽喉癌、非小细胞肺癌（NSCLC）及小鼠肺肿瘤模型的肿瘤微环境中被发现，同时在炎症性肠病（IBD）和葡萄糖苷酸盐（DSS）诱导的结肠炎模型患者的肠道中也有类似现象。然而，T-bet⁺Treg细胞在癌症中的发育过程和功能仍缺乏深入研究。

肿瘤微环境中pTreg细胞的积累

该研究对多种小鼠肿瘤模型中的Treg细胞亚群进行了分析。研究人员使用NRP1作为标记，区分了胸腺来源的tTreg细胞和外周诱导的pTreg细胞。研究发现，在淋巴结和脾脏中，大部分Treg细胞为NRP1⁺（即tTreg细胞），但在肿瘤中，超过一半的Treg细胞为NRP1^-（即pTreg细胞）。通过过继转移实验，进一步验证了这一结果。实验表明，肿瘤中的Treg细胞约有50%是pTreg细胞，这些细胞来源于常规CD4⁺T细胞。相比之下，淋巴结和脾脏中的Treg细胞主要为tTreg细胞。研究表明，肿瘤微环境可能通过促进pTreg细胞的积累，导致免疫抑制。

pTreg细胞在促进肿瘤生长中的重要作用

该研究接着探讨pTreg细胞在肿瘤免疫中的作用。研究人员通过过继转移方法选择性去除pTreg细胞，利用Foxp3^DTR小鼠和白喉毒素（DT）去除pTreg细胞，而不影响tTreg细胞，从而避免自身免疫反应。结果表明，去除pTreg细胞后，肿瘤生长被抑制。与此同时，肿瘤浸润性CD8⁺T细胞数量增加，并表现出更强的增殖能力和溶细胞活性。此外，肿瘤微环境中的髓系细胞群体比例发生变化，TAMs和单核细胞减少，中性粒细胞增多。进一步的治疗评估发现，在E.G7肿瘤模型的晚期去除pTreg细胞后，肿瘤生长得到抑制，CD8⁺T细胞比例增加，且肿瘤浸润的CD8⁺T细胞在总活细胞中的比例上升，特别是IFN-γ、颗粒酶B和CD107a的细胞比例。总体而言，去除pTreg细胞对荷瘤小鼠产生了有效的治疗效果。

肿瘤内Treg细胞高度表达T-bet转录因子

接着，该研究分析了肿瘤内Treg细胞是否在基因表达上与任何Th亚群相似，通过RNA测序对来源于Hepa1-6和E.G7小鼠肿瘤模型的肿瘤内Treg细胞进行转录组分析。结果表明，肿瘤内Treg细胞表现出Th1特征基因（如Tbx21和Ccr5）的上调，而Th2和Th17基因（如Gata3、Rorc和Ccr6）则下调。此外，肿瘤内Treg细胞的Nrp1表达低于淋巴结中的Treg细胞。进一步的流式细胞术分析显示，肿瘤内Treg细胞高度表达T-bet，但不表达RORγ t、BCL6或GATA3。T-bet⁺NRP1^-Treg细胞占肿瘤内Treg细胞的60%。总体而言，研究结果表明，T-bet⁺NRP1^-Treg细胞是多个癌症模型中肿瘤内Treg细胞的主要群体。

肿瘤内T-bet⁺pTreg细胞表现出增强的激活、增殖和抑制功能

进一步研究发现，肿瘤内的pTreg细胞与tTreg细胞相比，表现出更高水平的Th1相关基因上调。同时，pTreg细胞还表现出与Treg细胞抑制功能相关的基因上调，以及与激活、细胞周期调控和趋化因子受体相关的基因上调。研究人员还比较了肿瘤内pTreg细胞与肠道Treg细胞的基因表达特征，发现肿瘤内的pTreg细胞与肠道Treg细胞具有相似的基因表达谱，尤其是在非淋巴组织区域，如含有较高比例pTreg细胞的固有层中。这些结果表明，肿瘤内的T-bet⁺ pTreg细胞具有增强的激活、增殖和抑制功能，进一步强调了T-bet⁺ pTreg细胞在肿瘤微环境中的重要作用。

T-bet 对肿瘤内 pTreg 细胞的功能至关重要

该研究接着探讨了 T-bet 在肿瘤内 pTreg 细胞功能中的作用。通过生成特异性敲除 Tbx21 的 Foxp3^YFP-cre Tbx21^fl/fl 小鼠（KO组），并与 野生型小鼠（WT 组）进行对比，发现KO组肿瘤生长明显减缓，且肿瘤内 Treg 细胞数量显著减少。流式细胞术分析显示，T-bet 缺失后，肿瘤内的增殖性 Treg 细胞减少，CD8⁺T 细胞的激活和增殖提升，且肿瘤内 CD8⁺T 细胞与 Treg 细胞的比例增高。进一步的过继转移实验验证了 T-bet 在 pTreg 细胞功能中的关键作用。此外，将抗PD-1治疗与Treg细胞特异性敲除Tbx21联合使用，显著抑制了肿瘤生长，并延长了小鼠的生存期。总的来说，研究表明 T-bet 在肿瘤微环境中对 pTreg 细胞的功能至关重要，且其与抗 PD-1 治疗联合应用具有潜在的治疗效果。

Th1细胞通过TGF-β信号在肿瘤中转化为pTreg细胞

该研究进一步探讨了T-bet⁺Treg细胞在肿瘤微环境中的来源和分化路径。研究人员使用IFN-γ命运映射小鼠肿瘤模型，并结合过继转移实验，揭示了Th1细胞在肿瘤中可转化为pTreg细胞。实验中使用TGF-β受体缺失小鼠，发现阻断TGF-β信号可抑制这一转化过程，同时抑制肿瘤生长。综上所述，研究表明，Th1细胞通过响应TGF-β信号通路在肿瘤微环境中转化为pTreg细胞。

肿瘤内的Tbet⁺ Treg细胞表现出抑制性促肿瘤特征

接着，研究人员通过单细胞转录组分析，进一步阐明了肿瘤内T-bet⁺Treg细胞的发育过程及T-bet在该Treg细胞群体中的作用。研究使用Foxp3^YFP-cre和Foxp3^YFP-cre Tbx21^fl/fl小鼠，并将其与常规CD4⁺T细胞及无肿瘤淋巴结Treg细胞进行比较。基于基因表达数据，研究识别出五个不同的Treg细胞簇，分别代表不同的Treg细胞阶段或类型。其中，Th1样Treg细胞是最具主导地位的簇，占肿瘤内Treg细胞的至少70%。研究结果表明，Tbx21基因敲除导致Th1样Treg细胞减少，这一变化与抑制分子下调及Treg细胞功能丧失相关。进一步分析显示，T-bet缺失削弱了Treg细胞的抑制功能，尤其是CD39介导的代谢干扰功能。伪时间分析进一步证实，Th1样Treg细胞主要源自肿瘤内的Th1细胞和增殖性Treg细胞，表明TME中的Th1样Treg细胞是由Th1细胞转化为pTreg细胞。研究强调T-bet在维持Treg细胞抑制性及促肿瘤功能中的关键作用，并为肿瘤免疫治疗策略的开发提供了新的思路。

肿瘤内T-bet⁺ pTreg细胞高度表达CD39

该研究接着通过单细胞转录组学和流式细胞术，揭示了CD39在肿瘤内T-bet⁺ pTreg细胞中的特异性表达，并确定了CD39介导的免疫抑制作用是肿瘤内Th1样Treg细胞独特的机制。研究发现，Treg细胞在肿瘤中高度表达CD39，并与嘌呤代谢相关，暗示其在免疫抑制中的关键作用。CD39与CD73的共表达在肿瘤内Treg细胞中尤为突出，进一步表明T-bet⁺pTreg细胞具有独特的免疫抑制标志。此外，CD39的表达也在其他含有pTreg细胞高比例的组织中发现，如小肠和结肠的固有层。研究结果提示，CD39可以作为选择性调节T-bet⁺ pTreg细胞的潜在治疗靶点，为癌症免疫治疗提供了新的策略。

癌症患者肿瘤中的Treg细胞显著共表达T-bet和CD39

接下来，该研究进一步验证了核苷酸代谢是否为肿瘤内Treg细胞在人体癌症中发挥免疫抑制功能的重要机制。通过分析人类乳腺癌组织的RNA测序数据，研究发现肿瘤内Treg细胞的差异表达基因与小鼠肿瘤模型相似，尤其涉及核苷酸代谢相关的通路。此外，研究还发现，ENTPD1基因（编码CD39）在多种癌症类型的肿瘤内Treg细胞中普遍上调。通过多种人类癌症的单细胞RNA测序数据，进一步证实了TBX21（编码T-bet）与ENTPD1在多种癌症类型（如鼻咽癌、乳腺癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、肝细胞癌和结直肠癌）的肿瘤内Treg细胞中特异性共表达。流式细胞术分析也验证了肝癌患者样本中肿瘤内Treg细胞高度共表达T-bet和CD39。这些结果表明，T-bet和CD39的共表达是一种跨越多种人类癌症的免疫抑制机制，与小鼠肿瘤模型的发现相一致。这一新发现为开发针对肿瘤内T-bet⁺pTreg细胞的靶向治疗提供了理论基础，有望克服癌症中的免疫抑制。

靶向CD39能够激发抗肿瘤反应并增强抗PD-1治疗效果

综上所述，该研究探讨了肿瘤微环境中Treg细胞的起源、功能及其免疫抑制机制，重点分析了T-bet⁺pTreg细胞在肿瘤免疫中的关键作用。研究发现，这些Treg细胞主要来源于Th1细胞在TGF-β信号作用下转化，并通过CD39介导的代谢干扰抑制CD8⁺ T细胞功能。靶向CD39能够选择性地抑制T-bet⁺pTreg细胞的免疫抑制作用，而不影响免疫稳态。该研究为癌症免疫治疗提供了新的策略，有望在不引发自身免疫反应的情况下增强抗肿瘤免疫反应，推动精准免疫治疗的进展，预示着癌症免疫治疗的新突破。