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索氏梭菌（Paeniclostridium sordellii）是一种在环境中广泛存在的厌氧、产芽孢的革兰氏阳性细菌，可感染人和动物的胃肠道、生殖道、软组织等部位，引发腹膜炎、肌坏死、坏疽、败血症和中毒性休克综合征等。该细菌感染对于分娩或流产的女性风险尤其高，此类急性感染的致死率近100%。出血毒素（TcsH）是索氏梭菌产生的主要毒力因子之一，此前陶亮团队曾发现并报道了Transmembrane Serine Protease 2（TMPRSS2）是TcsH在细胞和宿主肠道上皮表面的受体（Nature Communions, 2022），但TcsH识别受体TMPRSS2的具体分子机制和结构基础仍然未知。
北京时间2024年3月4日，陶亮团队与施一公团队合作在 Nature Communications 上在线发表题为“Molecular basis of TMPRSS2 recognition by Paeniclostridium sordellii hemorrhagic toxin”的研究论文。在该研究中，研究者们利用单颗粒冷冻电镜技术解析了高分辨率的TcsH-TMPRSS2复合物结构，揭示了TcsH结合宿主细胞表面受体TMPRSS2的结构基础，并进一步通过生化、细胞和动物模型实验阐述了该受体介导毒素侵入的工作机制。TcsH通过其重复寡肽（Combined Repetitive Oligopeptides, CROPs）羧基末端的结构单元-VI与TMPRSS2的丝氨酸蛋白酶结构域（SPD）相互识别。这也是首次发现TcsH所在的大梭菌毒素家族成员的CROPs区域可以单独实现与蛋白受体的结合，该毒素-蛋白受体识别模式在大梭菌毒素家族中具有独特性。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-46394-6
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为了理解TcsH被细胞受体TMPRSS2识别的结构和分子机制，陶亮团队与施一公团队开展合作。研究者们首先在枯草芽孢杆菌系统中表达了全长TcsH蛋白，并在E293F细胞中分泌表达了TMPRSS2的胞外域TMPRSS2ECD，将两者稳定复合后利用冷冻电镜单颗粒三维重构技术解析了该复合物的三维结构。TcsH的核心区域（图2b, d）分辨率达到了3.2Å，其CROPs结构域向下弯折通过CROPs中后部的结构单元-IV与DRBD结构域桥接形成“关闭”的构象。CROPs的后半段羧基端“尾巴”分辨率较低难以看清，可能因为该部分柔性过大。不过研究者们在羧基端观察到了额外的电镜密度，推测可能是结合的TMPRSS2ECD。进一步的体外蛋白结合实验也支持TMPRSS2结合在CROPs的后半段区域（TcsH2210-2618），且两者的亲和力达到了纳摩尔级别。
于是，研究团队进一步重组表达纯化了CROPs的后半段截短体片段，用冷冻电镜解析了其与TMPRSS2ECD形成的复合物的高分辨三维结构，其互作界面分辨率达到了3.0Å。三维结构表明TMPRSS2通过SPD与TcsH的CROPs结构域的单元-VI结合（图2a-b）。研究团队进而重构了完整的TcsH-TMPRSS2ECD复合物的三维结构, 并且首次展现了完整的CROPs结构域（从结构单元-I到VI），呈现卷曲的β-螺线管结构（图2c-d）。
图2. TcsH-TMPRSS2ECD的高分辨冷冻电镜三维结构
通过对毒素和受体互作界面的分析发现, TMPRSS2通过SPD表面的5段Loop结构（LA, LB, LE, L2, L3），像手一样抓住了TcsH的CROPs结构域末端的单元-VI，其主要通过疏水相互作用加上少量氢键形成毒素-受体结合界面（图3）。SPD的这些表面Loop相比TMPRSS2的酶活性中心是高度不保守的，这解释了TMPRSS2识别TscH的特异性。基于相互作用的关键位点设计的一系列TcsH和TMPRSS2的点突变在体外蛋白结合实验中显著削弱了结合，并且具有相应突变的全长毒素在细胞中的毒性也显著降低，进一步验证了结构的真实性。
图3. TcsH通过其CROP unit-Ⅵ结合TMPRSS2的SPD结构域
有趣的是，研究者们还发现TcsH和受体的互作刚好封闭住了TMPRSS2的丝氨酸酶催化口袋，这意味着TMPRSS2的蛋白酶活性有很大可能被影响。基于此假设，研究团队进行了体外酶活抑制实验，证实毒素末端片段TcsH2210-2618的加入可以强烈抑制TMPRSS2的蛋白酶活性（图4），虽然这对于疾病发展的贡献尚不清楚，但可能具有潜在蛋白工程开发和应用的价值。
图4. TcsH的结合抑制了TMPRSS2的蛋白酶活性
最后，研究团队利用动物体内模型探究了TMPRSS2介导的TcsH入侵对小鼠肠道上皮的影响。与野生型TcsH相比，丧失TMPRSS2结合能力的TcsH突变体TcsHAAR对小鼠肠道造成的损害非常轻微。其炎症细胞浸润、出血、上皮受损的表型都不明显。这一结果支持了结构分析的关键相互作用位点，也进一步证明了TMPRSS2这一宿主受体在TcsH侵入和损伤肠道上皮的过程中起到了关键的介导作用（图5）。
图5. 丧失TMPRSS2结合能力的TcsH突变体对小鼠肠道上皮的破坏能力显著下降
西湖大学医学院、生命科学学院的研究员陶亮和西湖大学生命科学学院副研究员占谢超（施一公团队）为本文的共同通讯作者；施一公团队的周若瑜和陶亮团队的贺柳晴、张嘉豪为本文的共同第一作者。其他合作作者还包括西湖大学的李颜颜和张晓峰；课题受到了国家重点研发计划、浙江省“尖兵领雁+X”研发攻关计划、浙江省自然科学基金、西湖实验室（生命科学和生物医学浙江省实验室）和西湖基因组编辑中心的资助；项目实施还得到了西湖大学生物医学实验技术中心、实验动物中心和高性能计算中心的支持和帮助。
西湖大学微生物宿主交互实验室（实验室主页：https://tao.lab.westlake.edu.cn/）致力于研究微生物-宿主之间的相互作用方式和内在规律，尤其是从分子、生化、细胞、病理、遗传等多角度研究重要病原细菌及其致病因子对宿主的影响及作用机制。西湖大学医学院/生命科学学院研究员陶亮近年来以通讯作者在Cell、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Communications、PLOS Pathogens等学科主流期刊上发表十余篇学术论文。实验室长期接收博士后、博士生和科研助理的申请，方向包括且不限于微生物学、细胞生物学、化学生物学、分析组学、免疫学等，诚邀各方青年才俊加入、携手共同成长！（联系方式：taoliang@westlake.edu.cn）
